6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)试剂盒说明书 分光光度法 50 管/48 样 正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义: G6PDH(EC 1.1.1.49)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是磷酸戊糖途径的关键酶,催化 6-磷酸葡萄糖氧化为 6 -磷酸葡萄糖酸内酯,同时将NADP+还原为NADPH,供 生物合成及维持细胞内的还原状态用。因此 6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的高低可以从一定程 度上反映出生物体的生物合成和抗氧化能力。 测定原理: G6PDH 催化NADP+还原生成NADPH,在340 nm 下测定NADPH 增加速率。 需自备的仪器和用品: 紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。 试剂的组成和配制: 提取液:60mL×1 瓶,4℃保存; 试剂一:液体47.5 mL×1 瓶,4℃保存; 试剂二:粉剂×1 支,-20℃保存; 试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存; 样本的前处理: 1、细菌、细胞或组织样品的制备: 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量 (104 个):提取液体积(mL)为1000~5000:1 的比例(建议2000 万细菌或细胞加入1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30 次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0.1g 组织, 加入1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 2、血清(浆)样品:直接检测。 测定步骤: 1、分光光度计预热30min 以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。 2、将试剂二和试剂三转移至试剂一中充分溶解;在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种) 水浴10min 以上;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。 3、在1mL 石英比色皿中加入50μL 样本和950μL 试剂一,混匀后立即记录340nm 处1min 后吸光值A1 和 6min 后的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。 注意:若ΔA 大于0.5,需将酶液用提取液稀释,计算公式中乘以相应稀释倍数。或将反应 时间缩短至2min,使A2-A1 小于0.5,可提高检测灵敏度。 原创作者:青岛捷世康生物科技有限公司 |