谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）说明书分光光度法 50 管/48 样 注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： GSH-Px 是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽（GSH）氧化的主要酶。GSH-Px 不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与 ROS 反应，生成氧化型谷胱甘肽 GSSG，从而保护 生物膜免受 ROS 的损害，维持细胞的正常功能；而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮 抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。 测定原理： GSH-Px 催化 H2O2 氧化 GSH，产生 GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化 NADPH 还原 GSSG， 再生 GSH，同时 NADPH 氧化生成 NADP+；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，而 NADP+ 没有；通过测定 340 nm 光吸收减少速率来计算 GSH-Px 活性。 自备仪器和用品： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水。 试剂组成和配置： 试剂一：液体 100mL×1 瓶，室温保存。 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。 试剂三：液体 20μL×1 支，-20℃保存。 混合试剂配制：临用前，在试剂二中加入试剂一 40 mL，充分震荡溶解后加入全部试剂三， 混匀。（注意：必须现配现用，当天使用完） 试剂四：液体 5.1mL×1 瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 测定操作： 1. 分光光度计预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。 2. 混合试剂在 25℃或者 37℃（哺乳动物）水浴中预热 30min。 3. 测定管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 试剂四、800μL 预热的混合试剂、100μL 上清液， 迅速混匀后于 340nm 处测定第 10 s 和第 190s 的吸光值，分别记为 A 测 1 和 A 测 2，△A 测定管= A 测 1﹣A 测 2。 计算公式： (1). 按蛋白浓度计算 GSH-Px 活力单位定义：一定温度中，每 mg 蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶 活单位。 GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[△A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷（Cpr×V 样）÷T =536×△A 测定管÷Cpr (2). 按样本质量计算 GSH-Px 活力单位定义：一定温度中，每 g 样本每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活 单位。 订购电话：40090 25885
青岛捷世康生物科技有限公司 www.jisskang.com GSH-Px (nmol/min/g)=[△A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T =536×△A 测定管÷W （3）按细胞数量计算 活性单位定义：一定温度中，每 104 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。 GSH-Px (nmol/min/104 cell)= [△A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T =536×△A 测定管÷细胞数量 （4）按液体体积计算 活性单位定义：一定温度中，每毫升液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。 GSH-Px (nmol/min/mL)=[△A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷V 样÷T =536×△A 测定管 ε：NADPH 摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cm；V 反总：反应体系总体积，1000μL=0.001 L； 106：1mol=1×106μmol； Cpr：上清液蛋白浓度（mg/mL）；V 样：加入反应体系中上清液体 积，100μL =0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间，3 min。 注意事项： （1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力； （2）混合试剂和底物液须临用前配制，配完后置于冰上，当天使用完； （3）测定过程操作须迅速； （4）细胞中 GSH-Px 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中 GSH-Px 的提 取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。 原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司 |
