glutathione peroxidase, GSH-Px分光光度法 50 管/48 样 注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。 测定意义: GSH-Px 是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶。GSH-Px 不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与 ROS 反应,生成氧化型谷胱甘肽 GSSG,从而保护 生物膜免受 ROS 的损害,维持细胞的正常功能;而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮 抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。 测定原理: GSH-Px 催化 H2O2 氧化 GSH,产生 GSSG;谷胱甘肽还原酶(GR)催化 NADPH 还原 GSSG, 再生 GSH,同时 NADPH 氧化生成 NADP+;NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰,而 NADP+ 没有;通过测定 340 nm 光吸收减少速率来计算 GSH-Px 活性。 自备仪器和用品: 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水。 试剂组成和配置: 试剂一:液体 100mL×1 瓶,室温保存。 试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。 试剂三:液体 20μL×1 支,-20℃保存。 混合试剂配制:临用前,在试剂二中加入试剂一 40 mL,充分震荡溶解后加入全部试剂三, 混匀。(注意:必须现配现用,当天使用完) 试剂四:液体 5.1mL×1 瓶,4℃保存。 粗酶液提取: 1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。 2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建 议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体:直接测定。 测定操作: 1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。 2. 混合试剂在 25℃或者 37℃(哺乳动物)水浴中预热 30min。 3. 测定管:依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 试剂四、800μL 预热的混合试剂、100μL 上清液, 迅速混匀后于 340nm 处测定第 10 s 和第 190s 的吸光值,分别记为 A 测 1 和 A 测 2,△A 测定管= A 测 1﹣A 测 2。 计算公式: (1). 按蛋白浓度计算 GSH-Px 活力单位定义:一定温度中,每 mg 蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶 活单位。 GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[△A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷(Cpr×V 样)÷T =536×△A 测定管÷Cpr (2). 按样本质量计算 GSH-Px 活力单位定义:一定温度中,每 g 样本每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活 单位。 订购电话:40090 25885
青岛捷世康生物科技有限公司 www.jisskang.com GSH-Px (nmol/min/g)=[△A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T =536×△A 测定管÷W (3)按细胞数量计算 活性单位定义:一定温度中,每 104 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。 GSH-Px (nmol/min/104 cell)= [△A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T =536×△A 测定管÷细胞数量 (4)按液体体积计算 活性单位定义:一定温度中,每毫升液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。 GSH-Px (nmol/min/mL)=[△A 测定管÷ε÷d×V 反总×109]÷V 样÷T =536×△A 测定管 ε:NADPH 摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cm;V 反总:反应体系总体积,1000μL=0.001 L; 106:1mol=1×106μmol; Cpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);V 样:加入反应体系中上清液体 积,100μL =0.1 mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W,样本质量,g;T:反应时间,3 min。 注意事项: (1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力; (2)混合试剂和底物液须临用前配制,配完后置于冰上,当天使用完; (3)测定过程操作须迅速; (4)细胞中 GSH-Px 活性测定时,细胞数目须在 300 万-500 万之间,细胞中 GSH-Px 的提 取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。 原创作者:青岛捷世康生物科技有限公司 |