微量法 100T/96S注意：正式测定之选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。测定意义维生素 B6（Vitamin B6）又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，在细胞中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢，对生物体具有其重要的作用。 测定原理VB6 与 4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在 390nm 有特征吸收峰。 自备实验用品及仪器天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅、蒸 馏水。 试剂组成和配制提取液：液体 70mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 1mL×1 瓶，4℃保存。试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。 试剂三：液体 8mL×1 瓶，4℃避光保存。试剂四：液体 8mL×1 瓶，4℃避光保存。 样本处理1.组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 0.6mL 提取液）加入提取液，60℃浸提 30min，加蒸馏水 0.4mL，混匀后于 25℃，16000rpm 离心 10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心 20-30 分钟）。 2. 细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入 0.6mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 ，间隔 7 ，总时间 3min）；加蒸馏水 0.4mL，混匀后于 25℃，16000rpm 离心 10min，取上清测定。 3. 血清：直接测定。测定操作 | | 空白管 | 测定管 | | 样品（μL） | | 40 | | 试剂一（μL） | 40 | | | 试剂二（μL） | 40 | 40 | | 试剂三（μL） | 60 | 60 | | 试剂四（μL） | 60 | 60 | | 充分混匀，25℃反应 20min，于微量石英比色皿/96 孔板，测定 390nm 处吸光值， 记为 A 空白管和 A 测定管，△A=A 测定管-A 空白管。空白管只要做一管。 |
计算公式 a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下 标准曲线：y = 0.3635x+0.0205，R2 = 0.9986 1. 按照蛋白含量计算 VB6 含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反总÷（V 样×Cpr）
= 13.76×（△A - 0.0205）÷ Cpr
按照样本质量计算
VB6 含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反总÷（V 样×W÷V 样总） = 13.76×（△A - 0.0205）÷ W 1. 按照细胞数量计算 VB6 含量（μg/104 cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总） = 13.76×（△A - 0.0205）÷ 细胞数量 2. 按照液体体积计算 VB6 含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.3635×V 反总÷V 样 = 13.76×（△A - 0.0205） V 反总：反应总体积，0.2mL；：V 样：加入样本体积，0.04mL；V 样总：加入提取液体积， 1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g b．用 96 孔板测定的计算公式如下 标准曲线：y = 0.1818x+0.0205，R2 = 0.9986 1. 按照蛋白含量计算 VB6 含量（μg/mg prot）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V 反总÷（V 样×Cpr） = 27.52×（△A - 0.0205）÷ Cpr 2. 按照样本质量计算 VB6 含量（μg/g）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818 ×V 反总÷（V 样×W÷V 样总） = 27.52×（△A - 0.0205）÷ W 3. 按照细胞数量计算 VB6 含量（μg/104 cell）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总） = 27.52×（△A - 0.0205）÷ 细胞数量 4. 按照液体体积计算 VB6 含量（μg/mL）=（△A - 0.0205）÷ 0.1818×V 反总÷V 样 =27.52×（△A - 0.0205） V 反总：反应总体积，0.2mL；：V 样：加入样本体积，0.04mL；V 样总：加入提取液体积， 1mL； Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g 注意事项1. 若测定结果中吸光值超过 1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。 2. 蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定， 在计算公式中乘以稀释倍数。 3. 显色完成后立即进行测定。 原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司 |
