组织沉默调节蛋白3 （SIRT3）活性荧光定量检测试剂盒说明书

组织沉默调节蛋白3 （SIRT3）活性荧光定量检测试剂是一种旨在通过荧光探针氨甲基香豆素标记人工合成的乙酰化p53多肽底物，经过SIRT3脱乙酰基后，被位点特异性氨基肽酶水解，释放释放出具有强烈荧光的7-氨-4甲基香豆素，即采用荧光法来测定组织裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、线粒体蛋白样品、部分或纯化酶样品中SIRT3的活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

保存方式

保存缓冲液（Reagent C）、底物液（Reagent D）、终止液（Reagent E）、酶解液（Reagent F）和标准液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）和标准液（Reagent H）避免光照，有效6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品操作的容器

5毫升DOUNCE匀浆器：用于裂解细胞

（微型）台式离心机：用于细胞预处理

培养箱：用于反应物孵育

黑色96孔板或100微升1厘米光径比色皿：用于反应和荧光分析的容器

荧光酶标仪或荧光分光光度仪：用于荧光分析

实验步骤

实验开始，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、样品准备（线粒体蛋白）

1． 手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量 

2． （选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3． （选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4． 加入xx毫升裂解液（Reagent B）

5． 移入到预冷的5毫升DOUNCE匀浆器

6． 在冰槽里用匀浆棒匀化细胞（约20至40下）

7． 将所有细胞匀浆物移入1.5毫升离心管

8． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为1500g

9． 小心移出上清液到另一个新的预冷的1.5毫升离心管

10． 放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为10000g

11． 小心抽去上清液，保留沉淀颗粒

12． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀

13． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）

14． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、 测定准备

1． 准备好待测样品（例如线粒体蛋白或纯化酶样品等），置于冰槽里

2． 设定好荧光酶标仪或荧光分光光度仪（温度为30℃）：激发波长350-360nm；散发波长450-465nm 

3． 缓冲液（Reagent C）置于室温下均衡温度

4． 准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管

三、标准测定

1． 在黑色96孔板上做好相应标记：标准样品1至5管

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到相应孔里

3． 分别加入xx微升上述配制的标准液（Reagent H） 

4． 轻轻摇动黑色96孔板30

5． 即刻放进荧光酶标仪或转移到100微升比色皿，在荧光分光光度仪里检测：获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）读数

6． 构建标准曲线：纵座标（Y轴）为相对荧光单位（RFU）；横座标（X轴）为标准氨甲基香豆素浓度（微摩尔/升）

四、活性测定

1． 在黑色96孔板上做好相应标记：背景空对照和待测样品

2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到相应孔里

3． 分别加入xx微升底物液（Reagent D）

4． 分别加入xx微升补充液（Reagent G）或待测样品（50微克线粒体蛋白或200微克细胞裂解萃取液总蛋白）（注意：样品须清澈）

5． 轻轻摇动黑色96孔板30

6． 放进30℃培养箱里，孵育60分钟，避免光照

7． 分别加入xx微升终止液（Reagent E）

8． 分别加入xx微升酶解液（Reagent F）

9． 轻轻摇动黑色96孔板30

10． 在30℃培养箱里，孵育30分钟

11． 即刻放进荧光酶标仪或转移到100微升1厘米光径比色皿，在荧光分光光度仪里检测：获得相对荧光单位（Relative Fluorescence Unit；RFU）读数

12． 根据标准曲线获得样品对应氨甲基香豆素浓度（微摩尔/升）

四、 计算样品活性

方法一：RFU直接法

根据样品的荧光读数RFU作为样品酶活性单位

方法二：标准氨甲基香豆素浓度测算法

注意事项

1． 本产品为20次操作

2． 操作时，须戴手套

3． 系统操作过程中，标准测定只需1次

4． 注意增益倍数的设置

5． 样品须澄清，至关重要

6． 样品处理时，避免使用蛋白酶抑制剂、PMSF、烷基胺（alkyl amine）等

7． 孵育反应完成后即刻进行荧光测定

8． 测定值由低到高变化；测定持续60分钟

9． 测定值荧光读数越高，表明酶活性越高

10． 荧光测定后，比色皿须清洗充分

11． 待测样本为线粒体蛋白样品，其蛋白浓度为50微克/20微升；待测样本为细胞裂解悬液，其蛋白浓度为200微克/20微升（本公司提供  Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）

12． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

13． 样品活性计算根据用户要求，选择直接法或测算法；如果选择直接法，可以不必测定标准样品

14． 沉默调节蛋白3单位活性定义为：在30℃，pH 8.0条件下，每分钟内能够释放1纳摩尔氨甲基香豆素所需的酶量作为一个活性单位

15． 本公司提供系列组蛋白脱乙酰基酶检测试剂产品

质量标准

1． 本产品经鉴定性能稳定

2． 本产品经鉴定检测敏感

原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司