| 紫外分光光度法 注意：正式测定之选择2-3个预期差异大的样本做预测定 规格：50T/48S 产品内容： 提取液：液体60ml×1瓶，4℃保存。 试剂一：液体40ml×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存。临用加入3ml乙醇溶解备用。 试剂三：粉剂×2瓶，4℃保存。临用每瓶加入3ml双蒸水充分溶解待用。现配现用。 产品说明： C4H又称反式肉桂酸-4-单氧化酶，是催化桂皮酸形成咖啡豆、香豆酸的酶。C4H多存在于高等植物、酵母、菌类中，属于细胞木质素合成途径中间的关键酶。 C4H催化肉桂酸和NADPH生成4-香豆酸盐和NADP，在340nm下测定NADPH的减少速率，即可反映C4H活性。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、样本处理： 1、组织:称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。12000g,4℃离心15分钟，取上清，置冰上待测。 2.细胞或微生物样品的制备:先收集细胞或微生物样品到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或微生物加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞(功率20%，超声3s，间隔10s, 重复30次)。 12000g,4℃离心15min,取上清，置冰上待测。 二、测定步骤： （1） 紫外分光光度计预热30min，波长调至340nm。蒸馏水调零。 （2） 加样表：在1mL石英比色皿中分别加入
| 试剂名称（µL） | 测定管 | | 试剂一 | 700 | | 试剂二 | 100 | | 试剂三 | 100 | | 样品 | 100 | 充分混匀后立即测定10s时在340nm下的吸光度，记为A1，之后迅速将其放入37℃水浴或37℃培养箱中3min。然后迅速拿出擦净后测定190s时的吸光度，记为A2。计算∆A=A1-A2。 三、C4H活力计算：1、按蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟减少1nmol NADPH的酶量定义为一个酶活性单位。C4H（U/mg prot）=[∆A÷(ε×d)×109×V反总]÷(V样×Cpr)÷T =535.91×∆A÷Cpr。2、按样本鲜重计算：单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟减少1nmol NADPH的酶量定义为一个酶活性单位。C4H（U/g 鲜重）=[∆A÷(ε×d) ×109×V反总]÷(W÷V提取×V样)÷T =535.91×∆A÷W。 3、按细胞或微生物个数计算：单位的定义：每104个细胞或微生物在反应体系中每分钟减少1nmol NADPH的酶量定义为一个酶活性单位。C4H（U/104 cell）=[∆A÷(ε×d) ×109×V反总]÷(500÷V提取×V样)÷T =1.072×∆A。V反总：反应总体积，0.001L；ε：NADPH的摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入的样品体积，0.1mL；Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；W：样品质量，g；V提取：提取液体积，1mL；500：500万个细胞；T：反应时间，3min。 注意事项：1、当∆A大于0.4时，建议将样品用提取液稀释后测量；∆A过小时，建议增加酶促反应时间（5min或10min）或增加加入的样品体积来测定。 原创作者：青岛捷世康生物科技有限公司 |
