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负染的操作及注意事项

阅读人数:101 发布时间:2019/9/2 14:24:04

 负染的操作及注意事项
    滴染法:一般现将样品用拉长的毛细吸管一滴在被膜的载网上,用滤纸在载网上吸去多余的样品,使样品在载网上仅有一层水膜而无液滴存在。在水膜未干时,再加一滴复染液在铜网上,然后用滤纸靠在载网变上吸去多余的染液,这是常规的负染方法。由于病毒在液滴的边缘分布较多,上诉方法可能造成较多的病毒丢失,改良的方法是用毛细管在载网中部加1-1.5mm直径的一小滴病毒悬液。不用滤纸吸干而任其在自然状态下稍干后加入一小滴染液,也不用滤纸吸干,令其自然赶走。染液的密度取决于液滴的量和它的浓度,应经试验确定,此法对于一些浓度低的病毒样品可能获得较好的效果。
 
漂浮法:现将需负染的样品滴几滴在干净的载玻片上,再将有支持膜的载网漂浮在样品液滴上以沾取样品,用滤纸吸干样品余液使样品在载网上仅有一薄层液膜,在样品未干时即加一滴复染液的铜网上,用滤纸吸干多余的染液即可。也可在磷钨酸染液液滴中加入少许提纯的病毒混匀,讲有膜的铜网漂浮在液面上沾取有病毒的染液,用滤纸靠在铜网吸干。
 
喷雾法:将样品与染液混合,用特制的喷雾器将混合液喷洒在有膜的载网上。这种方法的优点是样品在载网上的分布十分均匀,但需要特殊的设备,故较少采用。而且染液和样品消耗量较大,又易造成病毒的扩散。
负染的时机十分重要,一般不应再载网上的样品完全干了之后,也不应该在载网上尚有肉眼可见的水珠时着手染色。应该在用滤纸吸干载网上的样品液滴,肉眼看不见残液,又未干燥时滴加染液。
提纯的病毒在负染时进行1:10-1:100倍的稀释,炫富病毒的缓冲液应尽可能稀一些,叫弄的缓冲液会使载网上产生许多盐类的结晶而影响图像的质量。缓冲液较浓时,宜先用双争辉稀释。
复燃用的载网支持膜(有时是碳膜),有时因疏水性的影响沾样后会形成一个球形液珠,用滤纸一吸即全部吸光,样品难以附着在支持膜上,遇到这种情况,需要离子溅射仪对载网进行沁水处理,改善支持膜的亲水性
复燃中常遇到颗粒悬滴样品的凝集现象,即生物样品与染色剂形成电子致密的团块,致使无法观察超微结构。这种现象是由多种因素引起的,除了上诉支持膜疏水性影响外,还可能是悬液浓度过大,悬液中细胞碎片过多,悬液PH值不适等,可以通过对样品稀释,惊醒2000-5000rpm离心和调节悬液PH值到中兴或偏酸性来解决。
悬液颗粒分散性差也可以用分散剂来加以解决
用0.005-0.05%牛血清白蛋白(BSA)加入提纯的病毒中,加入量无严格规定,一般0.5ml样品中加3-4滴即可,如效果不好可适当怎额增加,也可直接用0.01%BSA作为离心沉淀物的悬浮液。
将杆菌肽粉末按30-50ug/ml的浓度用蒸馏水配成溶液,用来稀释离心沉淀的颗粒标本或按适当比例加到需负染的样品中取,也可以按样品,磷钨酸和杆菌肽等量混合在滴到载网上,吸干即可观察。
除上诉两种分散剂外,还有人采用甘油丙二醇作为分散剂,也有人用1%二甲基亚砜(DMSO)加到染液里加强染液的穿透力和扩散作用,最近有人用十八(碳)烷的单分子层作为湿润剂,使不易染色的某些生物大恩自以着色。
某些病毒对复染色液较为敏感,负染色液会破坏形态结构,遇到这种情况,除改用其它种类的复染色液之外,还可在负染先用1%的戊二醛按比例与样品悬液混合,固定15分钟。或者在沾样后,将载网票在0.1%的戊二醛液滴上进行固定。也可以用四氧化e整齐xun蒸固定然后在做负染。
滴样后用双蒸水进行适当清洗,可以有效地改善负染效果。尤其是使用醋酸铀做负染色液时,应尽量洗掉样品中的缓冲液盐、组织汁液等,以免与负染液反应产生沉淀。经固定后的样品必须经过清晰,对直接取自蔗糖密度梯度或氯化铯密度梯度离心沉淀带的炫富样品,沾取后双蒸水适当清洗后,就可直接负染观察。
观察负染色的生物样品时,电镜应使用最小的武警光澜,以增大反差。加速电压可稍高一些,也增加电子的穿透能力。尽量避免电子束的长时间照射,一般在   3-4万倍的放大倍率下照像,均可获得高分辨率的电镜图像。
 
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